【仪器性能】

Bio-Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统采用QX200微滴发生器（dropletgenerator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴阅读仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0（因此该技术被称为"数字PCR"），最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。微滴化处理步骤是数字PCR的关键，使得每个微小的反应体系内进行单分子或几个分子的扩增，从而在如下方面的应用中具有突出的优势：

1、靶分子具有细微差异条件下的分析，如拷贝数变异；

2、在野生型序列构成的遗传背景中检测低频率的突变序列，灵敏度可达0.001%；

3、可实现无需标准品的绝对定量。

由于能够确定待检靶分子的绝对数目，因此QX200微滴式数字PCR特别适合如下应用：拷贝数变异、突变检测和基因相对表达研究等，并对遗传病、癌症、传染病的研究提供了一种全新的技术思路与手段。

【仪器特点】

Droplet Digital PCR (ddPCR™) 系统可对靶 DNA 或 RNA 分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或基于探针的数字 PCR 应用领域。灵活的数字 PCR 化学方法，通量达 96 个样品,便捷的测定设计，不需要标准曲线。

Droplet Digital PCR 技术和工作流程: Droplet Digital PCR 系统由两个仪器（微滴生成仪和微滴分析仪）及其相关的消耗品构成。液滴生成仪用于将 PCR 反应生成 20,000 个纳升大小的液滴。然后使用热循环仪进行 PCR 后，微滴分析仪将逐个分析每个样品中的液滴。微滴被吸入后，管路将分解乳化的液滴，并使它们依次通过一个双色光学检测系统。每次运行最多可处理 96 个样品。系统将计算阳性和阴性微滴的数量，从而以数字格式对靶 DNA 进行绝对定量分析。此外，对于经过 PCR 的液滴，还可以提取扩增的产品以用于下游环节，例如测序或克隆。

【技术应用】

1、基因表达量差异研究

检测时完全不依赖传统的Ct值即可实现真正意义上的绝对定量，从而提供了比实时荧光定量PCR更精确的基因差异表达研究，尤其对于那些靶基因表达差异微小的情况，如microRNA的表达分析，等位基因的不平衡表达，单细胞基因表达分析等等。

2、表观遗传学及基因组学的研究

（1）拷贝数变异（CNV）研究：微滴化的样品处理及检测，直接获取目标基因的绝对拷贝数，为拷贝数变异的研究提供了绝对的检测精度。

（2）甲基化含量鉴定：微滴式数字PCR系统通过对样品的微滴化处理及目标因子的绝对拷贝数定量，为甲基化程度的精确定量检测提供了一种全新的技术。

（3）低丰度及稀有序列的精确定量：微滴式数字PCR系统通过核心的微滴化处理，使得稀有的核酸序列从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度及精确性。如在体液（血液、尿液、粪便等）中对肿瘤核酸标记物的检测。

3、医学检测中的应用

（1）无创伤的产前诊断技术：如无创伤的产前诊断,如21染色体为3倍体的唐氏综合征(现有人使用二代测序进行深度测序)、已知父母基因型的胎儿地贫检测或已知父母基因型的其它核酸病检测（跟孟德尔遗传规律相关遗传）等。

（2）个性化基因治疗的应用：我们常用的检测标本常常是如血液、粪便、尿液等体液来源，对于这些标本中的DNA，其有两种来源途径：正常脱落体细胞的DNA和病变脱落细胞的DNA，而正常脱落体细胞的DNA量是远大于病变组织脱落细胞的DNA量的，为此通过微滴化处理就能在每个微滴中有效的减少体细胞DNA的干扰，实现肿瘤标记物的有效检测，可应用于个性化基因治疗(如肺癌等相关的EGFR、KARS、BRAF基因的SNP突变检测从而来指导用药方案的选择与调整)

4、与二代测序整合（Integration with next generation sequencing protocols）

数字PCR 可以与NGS 平台获得的数据进行相互印证。例如：使用数字PCR检测患者特异性标记物，与肿瘤配对末端测序实验结果进行相互验证，并且可以进行NGS文库的制备和定量。数字PCR 平台可以进行精准的绝对定量分析，极佳的数据重现性，而且样本需求极低。而且，数字PCR 的平台可以很好的整合实验流程，实现目标测序、个体生物标志物开发、化疗后外周血检测的完整研究路线。

5、其它

除此之外，微滴式ddPCR还可用于病原微生物检测、microRNA研究、基因表达研究、ChIP定量鉴定等领域，以及转基因成分鉴定、分子标准品精确定量、环境样本检测等工作。